Материалы и методы исследования

В исследовании «случай-контроль» приняли участие 2139 человека. Основная контрольная группа состояла из 1197 человек. В спортивную группу при исследовании полиморфизма MYF6 входило 563 спортсмена различных специализаций и квалификаций, ACTN3 - 942 спортсмена. Выборка для исследования с помощью подхода «генотип-фенотип» насчитывала 784 человек: 173 человека, входящих в общую группу спортсменов, и 611 физически активных здоровых людей.

Для анализа полиморфизма гена MYF6 группа спортсменов была разделена на пять подгрупп в соответствии с типом энергообеспечения и характером физической нагрузки:

I группа (n = 135) - умеренная мощность; выносливость;

II группа (n = 86) - большая мощность; выносливость;

III группа (n = 123) - переменная мощность; ловкость, быстрота, сила и выносливость;

IV группа (n = 119) - максимальная мощность; сила и быстрота;

V группа (n = 100) - максимальная мощность; быстрота и сила.

При исследовании полиморфизма ACTN3 спортсмены относились к одной из двух подгрупп: виды спорта с преимущественным проявлением скорости и силы (n = 486) и виды спорта с преимущественным проявлением выносливости (n = 456).

Молекулярно-генетические методы

Для молекулярно-генетического анализа использовали геномную ДНК испытуемых, выделенную из различного биологического материала (эпителиальные клетки ротовой полости, кровь и мышечная ткань).

Методика определения C964T полиморфизма гена MYF6 была разработана с использованием биотехнологической информационной базы данных NCBI, приложения «SNP» для идентификации мутации и программы «BLAST» для подбора праймеров.

Генотипирование образцов ДНК проводили при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двухпраймерной системы:

Прямой праймер MYF6: 5'-GAAGATCCCACCGACCCTTCCTGGC-3' Обратный праймер MYF6: 5'-GAGGCTAGACCTAAGCCACTCGCA-3' Прямой праймер ACTN3: 5'-CTGTTGCCTGTGGTAAGTGGG-3' Обратный праймер ACTN3: 5'-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3' Далее проводили ПДРФ-анализ, применяя для гидролиза ампликонов специфические эндонуклеазы рестрикции: SphI для MYF6 и Ddel для ACTN3. Анализ продуктов рестрикции проводился электрофоретическим разделением в полиакриламидном либо агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.

Гистоморфологический анализ мышечной ткани

Образцы мышечной ткани m. semitendinosus 8 физически активных здоровых мужчин фиксировали в 4% формалине и хранили в 80% растворе этанола при 4°C. Для приготовления гистоморфологического препарата проводили инклюзию образца в парафин и при помощи микротома получали срезы мышечной ткани. После дегидратации этанолом препараты окрашивали гематоксилином и эозином и просматривали в электронном микроскопе. Измерение ППС мышечных волокон осуществляли с использованием компьютерной программы «Infinity Analyse Software».

Иммуногистохимический анализ мышечной ткани

Биопсия скелетных мышц из m. vastus lateralis 15 физически активных здоровых мужчин и 26 конькобежцев проводилась сотрудниками Института медико-биологических проблем РАН (ИМБП РАН, Москва) под руководством проф. О.Л.Виноградовой. Иммуногистохимический анализ мышечной ткани выполняли с помощью иммунофлуоресцентной техники. Для выявления изоформ тяжелых цепей миозина (ТЦМ) применяли первичные антитела против медленных и быстрых ТЦМ и вторичные антитела, конъюгированные с FITC.

Метод магнитно-резонансной томографии и компьютерный анализ полученных изображений отдельных мышц

Компьютерные изображения МРТ нижних конечностей 548 рекрутов Великобритании получали, используя мобильный МР сканер 1.5 Tesla Siemens Sonata (работа выполнена сотрудниками University College London под руководством проф. Hugh Montgomery). Нами проводился анализ МРТ изображений с помощью компьютерной программы CMR-Tools©. Измеряли ППС m. rectus femoris правого и левого бедра до и после 12-недельной смешанной тренировки.

Аналогичным способом сотрудники ИМБП РАН проводили анализ МРТ изображений у 15 физически активных здоровых людей до и после силовой тренировки (классической и статодинамической). После определения ППС всего бедра, m. guadriceps femoris, m. rectus femoris, m. vastus lateralis, m. gluteus max, а также подкожного жира на передней и задней сторонах бедра с использованием программы Autocad 2000 проводили вычисление их объемов. У участников эксперимента также измеряли МПС. Оценка морфофункциональных показателей

Определение функциональных показателей аэробной и анаэробной работоспособности у 86 гребцов в тесте с нарастающей нагрузкой на механическом гребном эргометре было проведено сотрудниками ИМБП РАН. Замеры антропометрических показателей и композиционных показателей, а также сбор анкетных данных по силовым параметрам у 61 профессионального бодибилдера осуществлялся нами за день до начала турнира. Толщину кожно-жировых складок измеряли методом калиперометрии, функциональное состояние сердечно-сосудистой системы оценивали с помощью пульсометрии и измерением артериального давления.

Статистический анализ

Статистической анализ проводился с помощью программ GraphPad InStat, Statistica 6.0 или STATA 9.0. Сравнительный анализ осуществляли с использованием критерия хи-квадрат, точного теста Фишера, непарного t-теста Стьюдента и дисперсионного анализа ANOVA. Значение P < 0.05 считали подтверждением статистически значимых различий.

Результаты собственных исследований

1. Результаты генотипирования спортсменов и контрольной группы

1.1. Распределение генотипов и аллелей по гену MYF6

Впервые получено распределение генотипов и аллелей по полиморфизму C964T гена MYF6 в российской популяции. Частота встречаемости редкого C аллеля среди жителей Санкт-Петербурга составляла 42.3%, генотипы соотносились следующим образом: СС - 16.5%, СТ - 51.6%, ТТ - 31.9%. Сравнение полученных результатов со значениями базы данных SNP генома человека (The International HapMap Project) показало отсутствие различий в частоте встречаемости генотипов и аллелей гена MYF6 у жителей Санкт-Петербурга по сравнению с данными для европейской популяции. У жителей Великобритании (собственные данные) частота встречаемости генотипа ТТ была на 8% выше, чем у жителей Санкт-Петербурга (P = 0.03).

Статистически значимых различий между группой спортсменов и группой контроля обнаружено не было. При этом частота TT генотипа была выше, а частота гетерозиготного генотипа СТ ниже у спортсменов по сравнению с контролем, однако различие статистической значимости не достигало (ТТ P = 0.2; СТ P = 0.1). В таблице 1 представлены результаты распределения генотипов и аллелей по MYF6 в подгруппах спортсменов, разбитых на основании типа энергообеспечения и характера физической нагрузки, а также в отдельных видах спорта.

Увеличение частоты встречаемости Т аллеля и ТТ генотипа обнаружено у спортсменов I группы, занимающихся видами спорта на выносливость с умеренным проявлением мощности выполнения физической нагрузки (P = 0.07 и P = 0.044). При этом частота Т аллеля возрастала с ростом квалификации спортсменов-стайеров: квалифицированные спортсмены (1 разряд и КМС) - 62.0%; высококвалифицированные спортсмены (МС, МСМК и ЗМС) - 66.7%, и понижалась с ростом квалификации спортсменов-спринтеров: квалифицированные спортсмены -63.8%; высококвалифицированные спортсмены - 50.8% (P = 0.45, P = 0.06, соответственно).

Таблица 1 - Распределение частот генотипов и аллелей по гену MYF6 у спортсменов и в контрольной группе.

Примечание. * P₁ < 0.05 - статистически значимые различия в распределении всех генотипов между группами спортсменов и контрольной группой.

Таким образом, ТT генотип является благоприятным для развития и проявления качества выносливости, а полиморфизм гена MYF6 может быть ассоциирован с физической активностью человека.

1.2. Распределение генотипов и аллелей по гену ACTN3

Анализ частот встречаемости генотипов и аллелей по гену ACTN3 среди жителей России показал, что частота редкого X аллеля составила 38.7%. Генотипы распределились следующим образом: RR - 36.8%, RX -49.0% и XX - 14.2%. Эти результаты не отличались от данных, полученных при исследованиях полиморфизма R577X в различных европеоидных популяциях [Mills et al., 2001; Yang et al., 2003; Moran et al., 2007].

Распределение частот аллелей и генотипов по ACTN3 среди спортсменов отклонялось от равновесия Харди-Вайнберга (х² = 11.5; df = 2, P = 0.003), что указывает на произошедший спортивный отбор на основании генетической предрасположенности человека. Соотношение частот генотипов в общей группе спортсменов скоростно-силовых видов спорта статистически значимо отличалось от распределения в контрольной группе (P < 0.0001). Частота X аллеля оказалась ниже как у мужчин (34.3% против 39.8% в контрольной группе; P = 0.021), так и у женщин (30.5% против 37.8%; P = 0.034). В таблице 2 представлено распределение в группе спортсменов скоростно-силовой направленности с детальным рассмотрением по видам спорта. У представителей почти всех видов спорта в данной группе XX генотип и X аллель наблюдались реже, чем в контрольной группе. Обнаружена линейная зависимость между частотой встречаемости генотипа XX и спортивной квалификацией ЗМС - 3.4% (n = 29), МСМК - 4.2% (n = 71), МС - 7.3% (n = 206), КМС и первый разряд - 6.7% (n = 180) (P < 0.0001).

В таблице 3 представлено распределение генотипов по ACTN3 и частоты X аллеля среди спортсменов, занимающихся видами спорта, в которых для выполнения упражнений основным физическим качеством является выносливость. Распределение частот генотипов не подчинялось равновесию Харди-Вайнберга (?² = 14.2; df = 2, P = 0.0008), отличая группу спортсменов-стайеров от обычной популяции.

Таблица 2 - Распределение частот генотипов и аллелей по гену ACTN3 у спортсменов скоростно-силовых видов и в контрольной группе.

Примечание. *P < 0.05 - статистически значимые различия между группами спортсменов и контрольной группой. *P₁ < 0.05, различия в распределении всех генотипов. *P2 < 0.05, различия в распределении аллелей.

Таблица 3 - Распределение частот генотипов и аллелей по гену ACTN3 у спортсменов видов спорта на выносливость и в контрольной группе.

Примечание. *P < 0.05 - статистически значимые различия между группами спортсменов и контрольной группой. *P₁ < 0.05, различия в распределении всех генотипов. *P2 < 0.05, различия в распределении аллелей.

Как и в случае со спортсменами скоростно-силовой направленности, распределение частот генотипов среди спортсменов-стайеров статистически значимо различалось с контрольной группой (P < 0.0001). Носителями генотипа XX являлись всего 5.7% спортсменов (против 14.2% в контрольной группе; P < 0.0001). Частота аллеля X оказалась ниже среди спортсменов на 6% по сравнению с контролем (33.2% против 39.0%; P = 0.0025). При рассмотрении генетического распределения частот аллелей и генотипов по ACTN3 среди спортсменов разных полов выявлены статистически значимые различия по сравнению с контролем как у мужчин (6.8%, P = 0.0003), так и у женщин (3.7%, P = 0.003). Ни один из высококвалифицированных спортсменов-стайеров (ЗМС) (n = 30) не был носителем XX генотипа по гену ACTN3 (P = 0.016 по сравнению с контролем). Частота XX генотипа среди спортсменов с учетом их квалификации распределялась следующим образом: МСМК - 9.1% (n = 99), МС - 7.6% (n = 105) (P = 0.056) и КМС и первый разряд - 4.1% (n = 222) (P < 0.0001).

Полученные результаты свидетельствуют о благоприятном эффекте наличия R аллеля (генотипы RR и RX), а значит и наличия белка а-актинина-3 в скелетных мышцах, на двигательную деятельность любой направленности.

2.Ассоциация C964T полиморфизма гена MYF6 с морфофункциональными показателями спортсменов

Для проверки гипотезы о возможной ассоциации полиморфизма гена MYF6 с морфофункциональными показателями (всего 23 показателя) был проведен анализ данного полиморфизма в двух группах обследуемых. В первую группу входили 86 спортсменов, занимающихся академической греблей (32 женщины и 54 мужчины). Вторая группа состояла из 61 профессионального бодибилдера (21 женщина и 40 мужчин). В результате сравнительного анализа полиморфизма MYF6 не выявлено какой-либо статистически значимой ассоциации с композиционными, антропометрическими, силовыми и функциональными показателями спортсменов.

3. Ассоциация полиморфизмов C964T гена MYF6 и R577X гена ACTN3 с размером и композицией мышечных волокон

Для изучения ассоциации полиморфизма MYF6 с размером и композицией мышечных волокон было обследовано 8 здоровых физически активных мужчин (CC генотип - 2 человека, СТ - 2, TT - 4). Как видно из диаграммы (Рис.1), средняя ППС мышечных волокон оказалась больше почти в 2 раза у носителей генотипа ТТ (41385 ± 14636 мкм²) по сравнению с носителями гомозиготного СС (23065 ± 20691 мкм2) и гетерозиготного (25642 ± 20084 мкм2) генотипов (P < 0.0001).

Вторая экспериментальная группа состояла из 26 конькобежцев-многоборцев (СС генотип - 6 человек, CT - 10, TT - 10). Все обследуемые были квалифицированными спортсменами (МСМК - 2 человека, МС - 17 КМС - 7). Выявлено, что носители генотипа ТТ обладали большей ППС мышечных волокон (6278.8 ± 1560.4 мм2) по сравнению с носителями СС (5500.7 ± 852.7 мм2) и СТ (5195.4 ± 1278.8 мм2) генотипов (P = 0.04) (Табл.4). У носителей TT генотипа среднее значение ППС медленных мышечных волокон (6196.2 ± 1197.5 мм2) было выше, чем у СС гомозигот (5280.3 ± 401.5) (P = 0.09). Статистически значимых различий в процентном соотношении быстрых и медленных волокон у лиц с разными генотипами по гену MYF6 не обнаружено.

Рис.1. Средние значения ППС мышечных волокон m. semitendinosus у физически активных мужчин с учетом генотипа по MYF6. *P < 0.0001.

Таблица 4 - Композиция и ППС мышечных волокон в m. vastus lateralis у конькобежцев с различными генотипами по MYF6.

Для проверки гипотезы об ассоциации полиморфизма ACTN3 с размером и соотношением быстрых и медленных волокон скелетных мышц был проведен иммуногистохимический анализ ткани m. vastus lateralis у 55 здоровых физически активных мужчин. У людей с различными генотипами по ACTN3 статистически значимых отличий в процентном содержании мышечных волокон в m. vastus lateralis, а также в размере быстрых и медленных волокон не выявлено.

4. Ассоциация полиморфизмов C964T гена MYF6 и R577X гена ACTN3 с размером m. rectus femoris

Исследование, проводимое с целью поиска ассоциации полиморфизмов генов мышечных белков ACTN3 и MYF6 с размерами скелетных мышц человека, включало в себя анализ изображений МРТ нижних конечностей человека и сравнительный анализ между рассчитанной ППС m. rectus femoris и генотипами по данным генам. Для оценки однородности выборки проведен анализ антропометрических параметров участников эксперимента; статистически значимых различий в возрасте, росте и весе между носителями разных генотипов по MYF6 (P = 0.16) и по ACTN3 (P = 0.9) обнаружено не было. Среднее значение ППС прямой мышцы бедра было меньше у носителей гомозиготного генотипа СС (1413.11 ± 262.40 мм2) по сравнению с носителями СТ (1491.61 ± 264.17 мм2) и ТТ (1473.81 ± 245.16 мм2) генотипов (Р = 0.05) (Табл.5). После объединения носителей Т аллеля в единую группу (СТ и ТТ генотипы) было выявлено, что у носителей Т аллеля размер мышц был на 5% больше по сравнению с носителями СС генотипа по MYF6 (среднее значение ППС: Р = 0.022, правое бедро: Р = 0.037, левое бедро: Р = 0.018).

Таблица 5 - ППС m. rectus femoris в зависимости от генотипа по MYF6.

Примечание. * Р < 0.05.

Изучение ассоциации полиморфизма гена ACTN3 с размерами m. rectus femoris проводилось по схеме, аналогичной изучению гена MYF6. Статистически значимых различий при сравнении ППС m. rectus femoris у носителей различных генотипов по гену ACTN3 обнаружено не было (Табл.6). Можно отметить тенденцию к увеличению размера исследованной мышцы у носителей R аллеля (RR - 1489.73 ± 248.10 мм², RX - 1464.97 ± 273.03 мм2) по сравнению с ХХ гомозиготами (1451.97 ± 228.84; Р = 0.42).

Таблица 6 - ППС m. rectus femoris в зависимости от генотипа по ACTN3.

5. Ассоциация полиморфизмов C964T гена MYF6 и R577X гена ACTN3 со степенью гипертрофии m rectus femoris после смешанной тренировки

Влияние систематической мышечной деятельности на размер m. rectus femoris оценивали у рекрутов армии Великобритании с учетом полиморфизмов генов MYF6 и ACTN3. Тренировочная программа продолжительностью 12 недель включала упражнения на развитие выносливости и упражнения, развивающие скоростно-силовые качества. Среднее значение прироста m. rectus femoris обеих конечностей в группе обследованных (333 человека), полностью выполнивших тренировочную программу, составило 179.85 ± 137.95 мм2, или на 12% выше исходных значений среднего размера исследованной мышцы. Связь полиморфизма гена MYF6 со степенью гипертрофии мышцы не найдена, хотя имелась некоторая тенденция к повышению ППС m. rectus femoris у носителей ТТ гомозиготного генотипа (189.31 ± 150.45 мм2) по сравнению с носителями СС гомозиготного (170.09 ± 112.62 мм2) и гетерозиготного (173.26 ± 132.20 мм2) генотипов (Р = 0.46). После тренировки смешанной направленности у носителей разных генотипов по ACTN3 не было обнаружено статистически значимых различий в размере прямой мышцы бедра.

6.Ассоциация R577X полиморфизма гена ACTN3 со степенью гипертрофии отдельных мышц и мышечных волокон после силовой тренировки

Изучение ассоциации полиморфизма ACTN3 со степенью рабочей гипертрофии после 8-недельной силовой тренировки включала проведение оценки размера мышц и мышечных волокон, а также измерение МПС мышц у 15 здоровых физически активных мужчин. Семь человек тренировались по классической схеме силовой тренировки с нагрузкой 80-85% от МПС (RR генотип - 4 человека, RX - 3). Данная тренировка незначительно изменила состав мышечных волокон m. vastus lateralis обследуемых. Статистически значимых отличий в составе волокон у людей с различными генотипами по ACTN3 до и после тренировки выявлено не было. Разная степень увеличения содержания быстрых волокон (RR: 4.1 ± 2.5 %, RX: 6.7 ± 3.9 %) и уменьшения медленных волокон (RR: 3.9 ± 3.5 %, RX: 1.3 ± 1.7 %) в ходе тренировки также не имела статистически значимой корреляции с носительством того или иного генотипа (Р = 0.9 и Р = 0.8, соответственно).

После классической силовой тренировки прирост ППС быстрых и медленных мышечных волокон оказался больше у носителей RR генотипа (прирост: БВ - 1933.1 ± 548.2 мм², МВ - 1110.3 ± 258.8 мм²) по сравнению с носителями RX генотипа (прирост: БВ - 726.7 ± 108.8 мм², МВ - 678.6 ± 34.0 мм²) (Рис.2). Статистически значимая ассоциация между приростом ППС волокон и полиморфизмом по ACTN3 не была обнаружена, однако тенденция была весьма значимой (БВ: Р = 0.058, МВ: Р = 0.088).

До и после классической силовой тренировки у испытуемых был проведен анализ МПС с учетом генотипов по ACTN3. Прирост МПС составил 392 ± 49 Ну носителей RR гомозиготного генотипа и 294 ± 49 Н - у носителей гетерозиготного генотипа (Р = 0.088).

Рис.2. Воздействие классической силовой тренировки на изменение ППС мышечных волокон с учетом генотипа по ACTN3.

Сравнительный анализ изменения композиционных показателей мышц в результате силовых тренировок проведен у семи испытуемых, которые тренировались по классической схеме и у восьми испытуемых, завершивших низкоинтенсивную статодинамическую тренировку без расслабления с нагрузкой 50% от МПС (RR генотип - 6 человек, RX - 2). После завершения тренировок обоих типов различия между носителями двух генотипов по ACTN3 в таких показателях, как прирост общей сухой мышечной массы бедра (без жира), изменение объемов всего бедра и жировой складки оказались статистически незначимыми. Результаты анализа увеличения объемов мышц бедра после силовых тренировок разного типа с учетом полиморфизма ACTN3 представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Динамика объемов мышц бедра после силовой тренировки с учетом генотипа по ACTN3.

После силовой тренировки, проводимой по классической схеме, прирост m. guadriceps femoris был выше у носителей гомозиготного генотипа RR по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа (118.09 ± 3.22 мм³ против 105.73 ± 4.68 мм ; Р = 0.09). После статодинамической тренировки тенденция к ассоциации полиморфизма гена ACTN3 с гипертрофическим эффектом выявлена для m. gluteus max. Увеличение объема данной мышцы после такого типа тренировки было также выше у носителей RR генотипа, чем у носителей гетерозиготного генотипа (114.39 ± 3.22 мм против 104.27 ± 3.11 мм³; Р = 0.15).